一般采用先染色好两种已知阴阳性的菌种做比较。

一般采用大肠杆菌（阴性，染色后应该是红色）和金黄色葡萄球菌（阳性，染色后为紫色）再对未知菌革兰氏染色后颜色与之前染的两菌作比较颜色红即为阴性菌，偏蓝紫色即为阳性菌。

想要比较更明显可以在同一载玻片上三种菌同时染色，左边放大肠杆菌，中间放未知菌，右侧放金黄色葡萄球菌~最后用混合涂片染色法判断染色是否成功：在载玻片同一区域用混合的革兰氏阴性菌和阳性菌混合涂片，再按初染、媒染、脱色、复染、镜检普通革兰氏一般步骤进行。

操作中要注意涂片不要太厚，以免脱色不完全造成假阳性，但脱色过度会造成假阴性。