《五号特工组第一部》的剧情主要发生在1937年“卢沟桥事变”后，讲述了地下党员欧阳剑平与四位身怀绝技的青年志士组成的“五号特工组”，与日本女间谍及汪伪特工机构对峙的故事。这五人分别是：特工马云飞、密码专家高寒、爆破专家李智博、被誉为“神偷”的何坚，他们一路艰险到达上海，住进法租界，伪装的公开身份是“上流社会”成员。

在剧中，他们遭遇到了劲敌，如日本女间谍南造运子和日军宪兵司令部间谍机关特高课、汪伪特工机构“76号”，还有日特高课长酒井美惠子，这是一条看不见的战线，却时刻都闪现着刀光剑影。五号特工组不仅和中共地下组织交往，同时也和国民党的特工部门合作，从粉碎日本间谍阴谋刺杀蒋介石，到击毙“帝国之花”南造云子；从揭露南京大屠杀的真相，到营救流亡的犹太原子能专家；从为新四军组织运送药品，到查明叛徒、护送来自延安的特派员到江南游击区；从秘密获取日军“长沙会战”的特级机密，到粉碎日特爆破衢州机场的计划。

此外，剧中还包含了马云飞和高寒的婚礼被不速之客打断，他们被迫再次出山，执行追查盗窃美国核武器资料的双料间谍吉川猛夫的任务。在这个过程中，五号特工组和以酒井朝香为首的日特展开了纵横千里的较量，一次次火中取栗，化险为夷，为抗战立下了卓著功勋。